蛋白層析柱是凝膠層析技術(shù)中的主體,一般用玻璃管或有機玻璃管。根據樣品混合物中各組分在固定相和流動(dòng)相中分配系數不同,從而分離的一種層析法。
(1)裝柱前要仔細看填料的使用說(shuō)明書(shū),每種填料都有自己的特性,以及特殊的裝柱方法,針對不同的空柱,也要注意方法可能不同,這一點(diǎn)非常重要:裝柱包括以后使用中不允許柱內進(jìn)入氣泡(bubblefree),柱頭事先也要排除氣泡。
(2)填料要加水攪拌成均勻懸液,懸液濃度依填料而不同,一般70-85%,迅速倒入空柱內,或吸或壓,流速和具體步驟看說(shuō)明書(shū)。
(3)所有柱子盡量做到填料均勻,尤其是用于凝膠層析的柱子。裝柱完成后,可用柱效測定的方法檢查裝填效果。一個(gè)裝填合格的柱子的理論塔板高度應是填料平均粒徑的2-4倍,在此范圍內越小越好。
(4)選擇合適的泵,盡量流速滿(mǎn)足要求,脈沖盡量小。選柱塞泵。
(5)準備上柱的液體應進(jìn)行過(guò)濾,至少是0.45micrometre。
(6)關(guān)于純化,首先要考慮的是你的目標:純度、數量、速度、收率等等,再根據樣品的具體情況,尤其是目標蛋白的性質(zhì),確定純化策略。
(7)至于蛋白層析柱測序,大概不到1mg應該足夠了。